棉蚜气味结合蛋白基因克隆和表达分析

【摘要】灵敏的嗅觉系统能够让昆虫精确地感知环境中的化学信号,进而影响昆虫个体寄主定位、取食、觅偶、交配、寻找产卵场等行为。气味结合蛋白(odorantbindingproteins,OBPs)在昆虫嗅觉信号识别中具有重要意义。对这类蛋白的深入研究,有助于了解昆虫嗅觉识别系统的机理。棉蚜(AphisgossypiiGlover)是重要的农业害虫。对多种杀虫剂产生抗药性给棉蚜的防控带来极大挑战。开发新型无公害有效的棉蚜防治技术是重要且迫切的需求。本研究利用生物信息学和分子生物学技术对AgosOBPs的生化特性、高级结构、表达谱等进行研究,为开发棉蚜的防控技术提供理论基础。主要结果如下：1AgosOBPs基因克隆及序列分析本研究以棉蚜转录组数据为基础,克隆得到8个AgosOBPs基因的完整序列。它们编码141～243个aa,预测分子量为15.745～26.056kDa,在N末端存在由18～24个氨基酸残基组成的疏水性信号肽,平均疏水性为-0.502～-0.071,均属于亲水性蛋白。AgosOBPs具有6个保守的半胱氨酸Cys残基,间距模式为C1-X22-28-C2-X3-C3-X37-43-C4-X824-C5-X8-C6。3对由Cys残基组成的二硫键将6个a螺旋连接起来,共同支撑着蛋白的三级结构。氨基酸同源性分析和系统进化分析结果表明AgosOBPs和同翅目蚜科昆虫OBPs的同源性很高。2棉蚜相对定量PCR内参基因筛选本研究克隆棉蚜7个候选内参基因的全长或主要片段。运用3种统计算法geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder评估它们在不同型态(有翅型和无翅型)、寄主寄主(棉花和木槿)、组织(头、胸、腹、足、触角)、发育阶段(若虫和成虫期)棉蚜样品中的表达稳定度。结果表明PPI和DIMT是不同型态、取食不同寄主、不同组织棉蚜样品qPCR数据分析的最优内参基因。PPI、RPII和DIMT是不同发育阶段棉蚜样品qPCR数据分析的最优内参基因。ACTB和18SrRNA不适合作为棉蚜qPCR内参基因使用。3AgosOBPs在棉蚜体内的表达谱分析运用qPCR对AgosOBPs在不同型态、取食不同寄主、不同组织(头、胸、腹、足、翅、触角)、不同发育阶段棉蚜样品中的表达谱进行了分析。AgosOBP2、AgosOBP3、AgosOBP6和AgosOBP8在棉蚜若虫初期和成虫末期出现两个表达高峰期,AgosOBP4和AgosOBP7分别在棉蚜1龄若虫和成虫末期出现一个表达高峰期。AgosOBP1在触角中高水平表达。AgosOBP2在头部高水平表达。AgosOBP3和AgosOBP4在腹部高水平表达。AgosOBP6除在触角中高水平表达外,在头部也具有很高的表达水平。AgosOBP8在除足、翅外的其他组织中均具有较高的表达水平。AgosOBP2、AgosOBP6、AgosOBP8在有翅型棉蚜成虫中的表达量高于无翅型棉蚜成虫。AgosOBP4在有翅型棉蚜若虫中的表达量高于无翅型棉蚜若虫。AgosOBP3和AgosOBP1在无翅型棉蚜中表达量高于有翅型棉蚜。AgosOBP2在冬寄主木槿上有翅型棉蚜成虫中的表达量显著高于夏寄主上棉蚜oAgosOBP3和AgosOBP6在夏寄主上有翅型棉蚜成虫中的表达量高于冬寄主木槿棉蚜中的表达量。AgosOBP4和AgosOBP8在秋蚜和木槿棉蚜中的表达量较高,AgosOBP7在木槿棉蚜和苗蚜中的表达量较高。AgosOBP2、AgosOBP3、AgosOBP6、AgosOBP7在夏寄主无翅型棉蚜成虫中表达量高于冬寄主上木槿棉蚜成虫中的表达量。对AgosOBPs的表达谱分析有助于理解它们的不同生理功能。4应用原核表达技术对棉蚜气味结合蛋白进行表达分析构建表达载体PGEX-4T-1/AgosOBPs,在IPTG诱导下将重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达。所得融合蛋白的分子量与预测蛋白分子量大小一致,以包涵体的形式存在于菌体沉淀中。融合蛋白的成功表达为进一步研究棉蚜气味结合蛋白的结构和功能打下基础。
【作者】徐素平；
【导师】雷朝亮；崔金杰；
【作者基本信息】华中农业大学，农业昆虫与害虫防治，2014，硕士
【关键词】棉蚜；气味结合蛋白；内参基因；表达谱分析；原核表达；

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